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El fraccionamiento celular es una técnica bioquímica utilizada para separar los distintos orgánulos y componentes celulares para su estudio. La técnica se inicia con la homogeneización. El tejido se tritura en un homogeneizador de manera que las células se comprimen y se libera su contenido. Lo que luego se hace con ese extracto es someterlo a diferentes centrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, de manera que obtenemos fracciones enriquecidas de los distintos orgánulos.
Procedimiento:
Partimos de 0,5 gramos de hígado de pollo y de una solución madre de TRIS-HCL 1M. Necesitamos para el homogeneizado 10 ml de solución TRIS-HCl 10 mM, por lo que tomamos 10 microlitros de la solución madre y rellenamos con agua destilada hasta 10ml.
En un émbolo de potter ponemos los 0,5 gramos de hígado de pollo junto con 4 ml de solución TRIS-HCL 10mM. Machacamos hasta homogeneizar sin que quede ningún fragmento. Luego pasamos 1 ml del extracto a 3 tubos eppendorf marcados con la palabra nucleo y centrifugamos a 3000 rpm durante 5 minutos.
Después de esto, decantamos el sobrenadante a 3 tubos limpios y los marcamos con la palabra mitocondrias. EL pellet que ha quedado se denomina fracción nuclear y lo resuspendemos en 250 microlitros de sacarosa-TRIS. Almacenamos esta fracción a –20ºC para ensayos posteriores. Y centrifugamos el sobrenadante restante a 10000 rpm durante 10 minutos.
Una vez acabada la centrifugación, decantamos el sobrenadante a 3 nuevos tubos eppendorf marcados con la palabra microsomas. EL pellet que nos ha quedado es la fracción mitocondrial y lo resuspendemos en 250 microlitros de solución sacarosa-TRIS y almacenamos a –20ºC. Centrifugamos el sobrenadante a 12000 rpm durante 25 minutos.
Finalizada la centrifugación, decantamos el sobrenadante a 3 tubos eppendorf marcados con la palabra citosol y almacenamos a –20ºC. Lo que nos queda en el pellet es la fracción microsomal y la resuspendemos en 250 microlitros de solución sacarosa-TRIS y almacenamos.
Ahora observaremos la fracción nuclear. Para ello hacemos un frotis con una gota del tubo marcado con núcleo. Le echamos hematoxilina y dejamos durante 2 minutos. Lavamos con agua caliente, colocamos un cubre y observamos.
Observación de mitocondrias. Tomamos 200 microlitros de la fracción mitoncondrial del tubo marcado con mitocondrias y añadimos 300 microlitros de tampón TRIS-HCL y 500 microlitros de verde Jano 0,1%, de manera que estamos diluyendo la fracción mitocondrial 5 veces. Hacemos un frotis y observamos al microscopio óptico. Vemos cantidad de esferas y ovoides que deben corresponder a mitocondrias, lisosomas y peroxisomas. Pero es imposible poder diferenciar la ultraestructura.
Para hacer un recuento de las mitocondrias, hacemos uso de un hemocitómetro. Colocamos un cubreobjeto sobre el aparato. Éste posee dos huecos a los lados del cubre, de manera que se inyecta la suspención con colorante en esas huecos que luego pasa por debajo del cubre y se llena la cámara por capilaridad. Y observamos al microscopio óptico para hacer recuento.
EL hematocitómetro posee bajo el cubre una zona cuadriculada, de manera que hace fácil el recuento de los orgánulos. Cada cuadrícula representa 0,1 mm cúbico, es decir, 0,0001 cm a la cuarta. 1cm cúbico=1ml.
Luego, el número de mitocondrias por ml es igual a la media de mitocondrias por cuadrículas x factor de dilución.
El número total de mitocondrias en la alícuota que tomamos sería el número de mitocondrias por ml x volumen de alícuota.

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