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Una característica del ARNm es una cadena monocatenaria lineal que posee una cola poli-adenina, que utilizaremos como base para purificar el ARN, puesto que usaremos esferas magnéticas, partículas con núcleo de hierro, con una cola poli-timina, que es la complementaria a la cola poli-a del ARNm.
En un émbolo de potter homogenizamos durante 2 minutos 50 mg de tejido en una solución de lisis. Esto hay que hacerlo en presencia de hielo para que no se desnaturalicen los componentes debido al calor producido por la fricción. Pasamos el lisado a tubos eppendorf, todo, hasta la espuma. Y centrifugamos a 14000 rpm durante 15 minutos y obtendremos en el sobrenadante el ARNm aparte de otras moléculas como proteínas, otros ácidos nucleicos…
tenemos 50 mg de tejido. Si en 1 gramo de tejido se precisa 40 mg de esferas, en 0,050 gramos necesitamos 2 mg de esferas. Y si tenemos una solución tampón con esferas a 10 mg/ml, entonces precisamos de 0,2ml de tampón con esferas magnéticas. Tomamos los 0,2 ml del tampón agitado previamente y lo sometemos a imán durante un minuto, observando como se va aclarando la solución. Cuando las partículas queden capturadas y la solución aparezca clara, quitamos el tampón de almacenamiento con una micropipeta. Luego retiramos el tubo del imán y añadimos 0,2ml de tampón de lisis que utilizamos para homogeneizar el tejido en el potter, agitamos y volvemos a capturar durante 30 segundos aproximadamente, hasta aclarar la solución. Esto se hace para utilizar la misma solución tampón con la que se trabajan las muestran.
Eliminamos el tampón de lisis de las partículas magnéticas y añadimos el sobrenadante resultado de la centrifugación y dejamos que reaccione con las partículas durante 5 minutos. Una vez este tiempo, volvemos a capturar las partículas magnéticas con imán, pero esta vez con el ARNm unido, puesto que la cola poli-a del ARN es complementario a la cola poli-t de las esferas magnéticas.
Eliminamos el sobrenadante y lavamos las partículas 3 veces con 1 ml tampón de lavado, agitando para resuspender y capturando durante 1 minuto. Después de eliminar el último baño de tampón, añadimos 0,5ml de agua destilada y agitamos brevemente para resuspender las esferas-ARNm.
Colocamos la solución resultante en un baño de agua a 60ºC durante 10 minutos, de manera que se separa el ARNm de las partículas magnéticas. Terminada la incubación, se capturan las partículas durante 1 minuto y transferimos la solución a un tubo con 2 microlitros de glucógeno y 50 microlitros de acetato sódico 3M pH 5, 2 y agitamos en vortex. El glucógeno se utiliza para aumentar la densidad de la solución y para poner ver el pellet al centrifugar.
Tenemos pues una solución con un volumen de 0,552ml. Añadimos 0,6 volúmenes de isopropanol ice cold (0,331ml), agitamos y centrifugamos a 14000 rpm durante 15 minutos. Y los ARNm precipitan.

Regeneración de partículas magnéticas: Podemos regenerar las partículas magnéticas añadiendo 0,5 ml de tampón de regeneración de partículas, agitamos e incubamos a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se capturan luego las partículas eliminando el tampón de regeneración y lavamos 4 veces con tampón de almacenamiento con 0,5 ml de tampón cada vez, lavando y capturando. Con el último lavado, pasamos la solución a un tubo eppendorf de 1,5 ml nuevo, capturamos y resuspendemos en 2 microlitros de tampón de almacenamiento y marcar el tubo con la especie del tejido con la que se han utilizado las esferas magnéticas. Almacenar a 4ºC.

Después de 15 minutos de centrifugación, transferimos el sobrenadante a otro tubo y guardamos a –20ºC. Al pellet añadimos 0,5ml de alcohol 70% (-20ºC) sin agitar, centrifugamos a 14000 rpm durante 5 minutos, de forma que así lavamos el pellet. Aspirar el etanol con cuidado y volver a centrifugar unos 20 segundos, aspirar de nuevo el alcohol. Resuspendemos el pellet en 0,02ml de agua DEPC, centrifugamos 1 minuto a 14000 rpm y guardamos a –70ºC. Y ya hemos purificado el ARNm.

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