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Estudio de las células y los tejidos

 

METODOS DE ESTUDIO DE LA MORFOLOGIA CELULAR

1. Estudio de las células vivas: Método “in vivo”: se realiza a organismos o células vivas en su estado natural incluso orgánulos celulares. Se utilizan colorantes llamados colorantes vitales, estos no causan daño al organismo o célula durante un tiempo corto, a largo plazo son tóxicos y mortales.
Método “in Vitro”: estudia al organismo vivo pero colocado en condiciones artificiales. Se realiza en células aisladas y fáciles de separar. Estas células se colocan sobre un sustrato adecuado que se llama medio de cultivo en el cual se mantienen con vida mientras dura el estudio conocido como cultivo celular.
2. Estudio de celulas muertas
A) FIJACIÓN: cuando el animal muere es necesario detener sus procesos vitales antes de una autolisis de sus materiales. Este proceso es conocido como fijación. Conserva las células y tejidos en un estado lo mas parecido posible en morfología y composición química al estado vivo.
Modo de actuación:
1. Se insolubilizan las proteínas
2. Evita autolisis de los constituyentes de las células debido a sus propias enzimas desprendidas por los lisosomas de las células.
3. Protege a las células del ataque bacteriano.
4. el tejido para posteriores tratamientos como la tinción, el corte…
Fijación física:
Por calor: aplicamos calor de manera que se produce la coagulación de las proteínas. No es buena ya que las células se destruyen.
Por frío: se congela el tejido con dióxido de carbono o N liquido. Es mejor que la anterior pero se pueden formar cristales.

Fijación química: (por medio de sustancias químicas disueltas)

1. Un solo liquido fijador:
Microscopia OPTICA:
Formaldehído: produce la reticulación de proteínas
Ac. Acético: cambia el estado coloidal de las proteínas.
Ac. Pírico y dicromato potasico: actúan formando sales.
Alcoholes etílico y metílico: producen deshidratación.
Microscopía ELECTRONICA:
Glutaraldehido: reticulación de proteínas
Tetraoxido de Osmio: reticulación de proteínas.

2. Mezclas fijadoras:
Microscopia OPTICA: Bouin: formado por una mezcla de formaldehído, ácido acético y ácido pírico.
Microscopía ELECTRONICA: Se utiliza glutaraldehido mezclado con paraformaldehido.

Tipos de fijación química:
Perfusión: se coloca el fijador en una jeringuilla inyectándoselo al animal en el torrente sanguíneo de manera que el fijador se distribuye por todo su organismo. Una vez fijado podemos abrirlo para obtener nuestro órgano.
Inmersión: se mete el órgano en un recipiente con fijador. Esta técnica depende del tamaño de la muestra el volumen del fijador y todo esto influirá en el tiempo de fijación.
La fijación tb depende de la velocidad de penetración del fijador (tetraóxido de osmio lento, formaldehído rapido). El tejido debe sacarse del fijador ya que el fijador puede estropearlo. Después de sacar el tejido realizaremos la inclusión.
B) INCLUSIÓN: consiste en colocar el tejido fijado en una sustancia que lo conserve y le de consistencia y volumen para poder cortarlo (en secciones finas y delgadas).
Medios de inclusión:
Microscopia OPTICA: Utilizaremos parafina o paraplast que es un medio de inclusión no hidrosoluble.
Microscopía ELECTRONICA: Utilizaremos resinas epoxi como el epón, araldita y metacrilato o gelatinas y agar que son medios hidrosolubles.
Etapas de inclusión: (deshidratación, aclaramiento, y realización del bloque o inclusión)

Microscopia OPTICA, INCLUSIÓN EN PARAFINA:
Deshidratación: consiste en quitarle el agua al tejido ya que la parafina es no hidrosoluble. Para ello lavamos en agua el fijador. Se realizara con alcoholes de pureza ascendente hasta llegar a alcohol puro que no es soluble en parafina.
Aclaramiento: se sustituye este alcohol por un líquido intermediario normalmente el hidrocarburo bencénico (silol, benceno, tolueno).
Impregnación: el tejido se coloca en parafina liquido, esta parafina es liquida a 60 grados (a tº ambiente es sólida). El tejido se impregna de parafina sustituyéndola por el silol.
Inclusión: se saca el tejido de la parafina y lo ponemos en el fondo de un molde metálico y lo rellenamos de parafina liquida colocándolo a tº ambiente de manera que la parafina se solidifica quedando el bloque realizado y preparado para el corte.

Microscopía ELECTRONICA, INCLUSIÓN:
Deshidratación: se realiza con alcoholes de concentraciones crecientes al igual que con el M.O. A veces se pueden utilizar acetonas.
Aclaramiento: se utiliza un hidrocarburo bencenico en este caso el oxido de propileno.
Impregnación: se saca el tejido del oxido de propileno y se mete en un bote con la resina epoxi que a tº ambiente es liquida y el tejido se impregna.
Confección del bloque o inclusión: no se utilizan moldes metálicos sino las cápsulas de gelatina de los medicamentos. El tejido se saca de la resina y se mete en el fondo de la cápsula de gelatina. Seguidamente se introduce a 60 grados para que la resina epoxi se solidifique.

Una vez tenemos el bloque realizado procedemos a realizar el corte.
C) CORTE:
Microscopia OPTICA: el bloque hay que cortarlo en pequeñas secciones finas. Estas se cortan en un micrótomo (que tiene una cuchilla metálica) donde se realizan secciones de un grosor de 3 a 5 micras. Las secciones obtenidas se colocan encima de un cristal alargado llamado porta. Una vez en el porta podemos teñir la muestra. Para tejidos líquidos debemos realizar los frotis o extensión: se coloca encima del porta una gota de sangre y encima otro porta formando un ángulo perpendicular. Este porta se desplaza arrastrando la gota y formando en el otro porta una extensión de sangre.
Microscopía ELECTRONICA: los bloques para esta microscopía se colocan en el ultra micrótomo (que tiene cuchillas de diamante y vidrio) obteniendo así secciones muy finas llamadas ultrafinas de un espesor entre 200 y 500 manómetros. Estas secciones se recogen en unas estructuras redondas pequeñas que son las rejillas. Estas rejillas (de metal, + frecuente el cobre) con los trozos o ultrafinas pegados se contrastan.

D) TINCIÓN O CONTRASTE

M. OPTICO (tinción): antes de empezar la tinción hay que quitar la parafina del tejido ya que esta parafina no es hidrosoluble. Así que hay que introducir el porta en xileno quitando la parafina, llamado desparafinar. A continuación se hidrata con alcoholes de concentración decreciente desde xileno pasando por alcoholes hasta llegar a agua. Ya esta el tejido preparado para ser coloreado con hematoxilina y eosina pasándolos a agua para lavar el colorante. Debemos sellar el tejido para quitarle el agua y dejarlo conservado (EUKIT, DPX). Para esto se utilizan bálsamos que no son solubles en agua a si que debemos deshidratar el tejido y luego aclarar en xileno que si es soluble en los bálsamos. Echamos bálsamo y colocamos encima otro cristal mas pequeño llamado cubre. Con esta tinción las estructuras biológicas son resaltadas mediante colorantes capaces de fijarse selectivamente sobre ellos según su afinidad especifica, relacionada con su naturaleza química. Existen varios tipos de tinciones:
Tinciones vitales: teñir células vivas.
De rutina: la tinción de hematoxilina y eosina. Mediante esta tinción se puede demostrar la relación entre células tejidos y orgánulos.
Especiales: se tiñe una estructura en particular de la célula. (Ej. Técnicas histoquímicas).
Clasificación de colorantes:
Según su origen:
Naturales: tomados del medio natural
Artificiales: fabricados
Según su composición:
Ácidos: eosina: tiñen elementos básicos como citoplasma de un color rosa anaranjado.

Básicos: hematoxilina: tiñen elementos ácidos como el núcleo de color violeta.
Eosina y hematoxilina se emplean juntas al realizar una tinción para ver la célula entera.

Metacromáticos: tinción diferente a la del colorante utilizado, esta propiedad se llama metacromasia y el colorante cambia su color cuando actúa sobre ciertos componentes celulares.
Azul de toluidina (más importante) es azul pero cuando se pone en contacto con sustancias o elementos metacromáticos se vuelve violeta. Tiñe moléculas cargadas negativamente, moléculas de alto peso molecular y esteres de sulfato (glucosalinoglicanos).
Mecanismos de coloración:
1. Disolución: se emplean colorantes liposolubles además el tejido se fija por congelación. Sirve para teñir lípidos o grasas. Posee la propiedad de que son más solubles en los lípidos que el solvente que los contiene por eso tienden a abandonar la solución para incorporarse a los lípidos del tejido.
Colorantes:
Sudan III: tiñe lípidos de color rojo
Sudan IV: tiñe lípidos de color negro
Tetraóxido de Osmio: tiñe lípidos de negro Cuando estos no se utilizan y se cambian por técnicas convencionales de tinción los lípidos del tejido se disuelven debido a los alcoholes de manera que se observan huecos blancos por la disolución de las grasas llamada visión negativa de las grasas.

2. Impregnación: se emplean metales como la plata, el plomo y el osmio utilizados en forma de óxidos o de sales los cuales son reducidos por los componentes celulares precipitando en forma de metales insolubles. El más utilizado es la plata, entonces hablamos de impregnaciones argénticas:
Gomori (especifica para fibras de reticulita), Reticulina y Verhoeff (para fibras elásticas) dan precipitados negros.
Clases de tinciones según el numero de colorantes:
Monocromicas: un colorante Policromicas: varios colorantes (ticrómicos).

Ticrómico de Masson: tiñe de color verde sobre toda fibra colágena de tejido conjuntivo.
Ticrómico de Mallory: tiñe de color azul las mismas fibras colágenas.

Microscopía ELECTRONICA (contraste):
No se utilizan colorantes, no se observan colores solo blancos, grises y negros. Se utilizan sales de metales pesados para contrastar el tejido.
-Para M. Electrónico de transmisión:
Acetato de uranilo
Citrato de plomo
-Para M. Electrónico de barrido: Se sombrea la mezcla con carbono y con platino.

METODOS DE ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN QUIMICA DE LA CELULA (estudian los componentes químicos del interior de la célula).

Técnicas Histoquímicas:
1. Identificación de aldehídos:
Reacción plasmal: para poner de manifiesto los aldehídos libres de la célula.
Feulgen: para poner de manifiesto el ADN.
PAS (ácido periódico de Schiff): pone de manifiesto los hidratos de C.
PAS +: con hidratos de C
PAS -: sin ellos
Resultado: cuando hay aldehídos se observa color rosa fuerte y en las tres técnicas se utiliza el reactivo de Schiff (incoloro). Este es la fuchsina decolorada con anhídrido sulfuroso.
Reacción plasmal: sencilla, si en el tejido estudiado hay aldehídos libres reaccionaran con el reactivo de Schiff produciendo un color rosa fuerte.
Feulgen: se produce en el tejido una hidrólisis ácida con ácido clorhídrico (HCL) con lo cual quedan grupos aldehídos libres, estos grupos son tratados con el reactivo de Schiff viéndose el color rosa fuerte.
PAS: se realiza una hidrólisis con ácido periódico quedando aldehídos libres que se ponen de manifiesto con el reactivo de Schiff y que deja de nuevo el color rosa fuerte.

2. Identificación de Enzimas (proteinas que manipuladas se desnaturalizan y se destruyen por ellos no se pueden fijar):
El tejido se fija por congelación.
Las 2 tecnicas más importantes: Fosfatasa ácida: tiñe enzimas marrón oscuro. Fosfatasa alcalina: las tiñe de negro. Se utiliza un sustrato sobre el que actúa la enzima que hay en la célula cuya presencia queremos poner de manifiesto.

Técnicas Auto radiográficas: se utilizan sustancias radiactivas (como isótopos radiactivos) que tienen afinidad a un determinado compuesto celular. Principales Isótopos: Trimidinatrinitada: afín con ADN, Uridinatrinitada: afín con ARN
Se coloca la célula en la sustancia radiactiva para enmarcar algún componente. Se lava y se coloca en parafina. Se corta y se coloca en un porta en una emulsión fotográfica que tiene cristales de bromuro de plata. El porta se revela como si fuera una foto. El cristal de bromuro de plata sobre el que ha incidido se transforma en un filamento de plata mientras que los cristales sobre los que no ha incidido ningún isótopo desaparecen. Al final al Microscopio Óptico observamos pequeños puntos que son los filamentos de plata.
Al M. Electrónico veremos los filamentos de plata perfectamente.
Técnicas Inmunocitoquímicas: (base-antígeno-anticuerpo)
T. Directa- fluorescencia
T. Indirecta- PAP (peroxidasa-antiperoxidasa)

Para M. Electrónico:
1. Tinción negativa: suspensiones de células
2. Sombreado: material inorgánico y suspensiones.
3. Criofractura: material biológico.

1. Tinción negativa: no se utilizan cortes sino suspensiones.
Sobre la rejilla se coloca la gota de suspensión de células la que se coloca una capa de ácido fosfotúnstico que se mete por todos los orificios de la célula. Como resultado veremos el fondo y los orificios de color ya que se han acumulado los metales pesados por tanto los electrones chocan se dispersan sin atravesar la muestra. El material lo veremos brillante ya que los electrones pueden atravesarlo al no depositarse sobre él metales pesados. Al final nos queda algo parecido al negativo de una foto.
2. Sombreado: se observa con detalle la superficie de partículas muy pequeñas. Se utiliza una campana al vacío. En un lado de esta tenemos una platina en cuyo borde se deposita la muestra sobre una rejilla con soporte de carbono. Al otro lado de la campana hay unos electrodos hechos de diferentes metales (platino, carbono). Los electrodos se calientan haciendo que le metal incida sobre un lado de la muestra. Seguidamente se disolvemos el material biológico quedándonos un molde de platino o del metal llamado replica. A veces se necesita reforzar la replica depositando además del metal una capa continua de carbono y enzima la replica.
3. Criofractura: la muestra se coloca sobre un soporte y se introduce en nitrógeno líquido con lo que se congela proceso llamado crío fijación. A continuación la muestra congelada se mete en una campana con una cuchilla que le da un golpe seco a la muestra que se fractura haciéndolo siempre por el sitio más débil. Después sobre una de las caras de fractura se deposita una capa continua de carbono, a continuación se realiza un sombreado de platino y por último se realiza la réplica.
-Congelación grabado: congelación y corte de cuchilla separándose por la membrana a nivel de la bicapa lipídica. Después se aumenta la Tº de manera que el hielo de superficie de fractura se sublima (sólido a gas) con lo que las partículas que están en la zona de fractura quedan mucho más marcadas.
Se deposita una película continua de carbono y sobre esta se sombrea con platino para obtener la replica disolviendo la materia orgánica.

Fraccionamiento celular: sirve para separar los distintos orgánulos de una célula, para ello las células se trituran y se centrifugan varias veces. En cada centrifugación se separa un orgánulo diferente de la célula (1º núcleo). Se observa a la velocidad a la que sedimenta cada orgánulo pudiendo saber el coeficiente de sedimentación expresado en unidades S (Svedberg) (Ej. Ribosomas 70s).

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