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Cultivo de microorganismos

 

Los microorganismos tienen distintas necesidades nutritivas, basadas en mecanismos de síntesis propios y rutas metabólicas. Los fototrofos usan la luz mientras que los quimiotrofos usan compuestos químicos.
Los seres vivos pueden usar distintas fuentes para conseguir los elementos esenciales para su supervivencia. La principales fuentes son las de carbono y energía pero también son necesarias otras para obtener nitrógeno, azufre, etc.
.- FUENTE DE CARBONO: CO2: autotrofos. Compuesto químico orgánico: Heterotrofo.
Algunos poseen un metabolismo obligado o facultativo.
.- FUENTE DE ENERGÍA: Luz: autotrofos. Compuestos químicos: Quimiotrofos.

.- FUENTE DE NITRÓGENO: Las plantas usan nitratos. Los animales usan nitrógeno orgánico. Los microorganismos usan nitrógeno por fijación, nitrógeno inorgánico y orgánico.
.- FUENTE DE AZUFRE: Las plantas usan sulfatos, (sales inorgánicas). Los animales usan proteínas, (compuestos orgánicos). Los microorganismos usan de todo, inorgánico (SO42-), orgánico (aminoácido), S0, etc.
.- FUENTES DE FÓSFORO. En general son sales

.- FUENTE DE SALES MINERALES: K, Ca, Mg, Fe, (mg/l) son micronutrientes. Mo, Mn, Zn, Co, Ni, (?g/l) son oligoelementos.
.- FACTORES DE CRECIMIENTO: Son aquellos elementos tales como las vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Si el organismo los necesita tomar del medio y no puede sintetizarlo hablamos de auxotrofos. Si por el contrario puede sintetizarlos hablamos de prototrofos. El ácido fólico o PABA: transferencia de un carbono.(L. casei), sintetiza Timina, Purina, Metionina, Serina, Ácido patoteico. Biotina: fijación del CO2.
Ácido nicotínico. Hemophlicus. Riboflavina. FMN, FAD, (Dhasa, cadena de transporte de electrones)
Ácido pantoténico: es parte de la coenzima A. Tiamina (TPP) descarboxilaciones, de las trascetolasas.
B6 o Piridoxina: fosfato de piridoxal (síntesis y degradación de aminoácido) transaminasa y deaminasas.
B12: Sintetizado po microorganismos para la síntesis de desoxirribosa. Ácido lipoico: Bacterias del ácido láctico. Co-M: Producción de metano. Vitamina k: Síntesis de esfingolípidos.

CULTIVOS. Un cultivo es el crecimiento de poblaciones microbianas de forma controlada en un medio artificial. Un cultivo según su composición química puede ser:
• Sintéticos: Tiene una composición química definida. Cuanto más simple es mejor purificamos los productos de la bacteria. • Complejos: su composición es no conocida, no sirve para purificar los compuestos pero en ellos puede crecer cualquier microorganismo. (Ej. caldo glucosado). Según el estado físico del medio los cultivos pueden ser: Líquido, sólido, semisólido. Depende de si el agar es más o menos gelatinoso. El agar es un compuesto formado por agarosa que es un polímero de galactosa al 70% y de agaropectina al 30%. Es sólido cuando existe el 1.5-2% de agar, semisólido (para estudios de mivilidad) cuando la concentración es de 0.15-04% y es líquido cuando hay menos del 0.15% de agar.
APLICACIONES:
• Medios enriquecidos: Añaden nutrientes a los cultivos donde el microorganismo exige mucho. (Ej. sangre para que crezca Hemofilus)
• Medios selectivos: Añaden compuestos al agar que permiten el crecimiento selectivo de los microorganismos. Ej. Cristal violeta: sólo crecen Gram-; Maltosa: Sólo crecen los que tengan la enzima maltasa; Penicilina: sólo crecen eucariotas; etc.)
• Medios diferenciales: Los microorganismos crecen de forma diferente, añadiendo al medio sustancias especiales (sangre). Se usa también viraje de colores. Ej. en sangre diferenciamos los organismos hemolíticos de los que no los son; en EMB (eosina azul de metileno vemos los que aprovechan lactosa de los que no; medio McConky (rojo neutro); en sales de pb vemos los productores de SH2 que dan un precipitado negro de lo que no lo producen.Un ejemplo típico es el caldo común, que es glucosa más extracto de carne, y peptona , se ajusta el pH, se añade NaOH, tamponamos, filtramos, espesamos y por último esterilizamos.

SIEMBRA: TÉCNICAS E INSTRUMENTOS:

.- INSTRUMENTOS: • Asa de siembra: picadura. • Asa de vidrio. • Pipeta Pasteur.

.- TÉCNICAS: • De líquido a placa: Se puede hacer de dos formas: a) Estría en placa, Asa de cultivo asa de vidrio. b) Extensión en placa.• De líquido a tubo: Se puede hacer: a) En tubo inclinado. Aumenta la superficie. b) En Tubo no inclinado. Por picadura. c) Semisólido. Por picadura.• También se puede transferir a un cultivo puro.

OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

1. Siembra en superficie. Extensión y estría.
2. Vertido en placa. Mezclando los microorganismos con agar fundido a 44ºC, y se echa luego sobre la placa. Los microorganismos crecen en la superficie y dentro
3. Técnicas de enriquecimiento. Aplicar el elemento adecuado (por ejemplo benzoato) al tubo de ensayo, se aíslan microorganismos que no se aíslan con los métodos anteriores y que están en pequeñas cantidades (como pueden ser aquellos que sólo usan benzoato). Se debe realizar varias veces para asegurarnos que tenemos un cultivo puro. (Otros ejemplos: elevada temperatura para termófilos; calentamiento a 80ºC para esporulados y termófilos.)
4. Dilución seriada. Sólo aíslo el microorganismo más abundante. (Lister con Streptococcus lactis hace diluciones, cada dilución la siembra en 20 tubos, cuando de un dilución dólo crece el 5% la probabilidad de que en ese tubo crezca 1 aólo tipo de microorganismo es del 4.8%, así estamos seguros de que sólo existe un tipo de microorganismo).
5. Micromanipulador: aislamos una sola célula utilizando este aparato.
6. Aislamiento de microorganismos anaerobios. Micromanipulados. Obtenemos los organismos anaerobios por una adición de agar a 44ºC, mezclamos y tapamos con parafina (aceite estéril). Eliminamos el O2 con agentes reductores (tioglicolato, añadimos un colorante REDOX para ver cuando se ha reducido), con una vela que consuma el oxígeno, usamos la jarra de anaerobios (sistema que produce CO2 + H2 y un catalizador que consume O2). Cuanto más sensibles son más precauciones tenemos que tomar. PARAFINA


CARACTERIZACIÓN DE CULTIVOS PUROS

• Las colonias deben ser iguales en forma, tamaño y color.
• Que no existan formas inhibidas.
• Al microscopio deben tener un aspecto común.
• Tiene que tener iguales propiedades tintoriales.
• Deben ser bioquímicamente y fisiológicamente iguales.
.- Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.

MANTENIMIENTO

1.- Debemos transferir periódicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora el agua.
2.- Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer más tarde, disminuye el metabolismo y tardan en envejecer.
3.- Se disminuye la temperatura, congelamos las células. Para proteger las células y que no se formen cristales que las dañen se usa el glicerol
4.- La liofilización es la sublimación a alto vacío de las muestras congeladas con rapidez.

 

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