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Observación de los microorganismos

 

El microscopio amplifica las señales y las recoge el ojo o las cámaras. Los objetos pueden ser luminosos o no luminosos que reflejen la luz. La retracción es un cambio en la trayectoria de la luz cuando los objetos poseen distinta densidad. Cuando la luz pasa de un medio a otro de diferente densidad cambia la trayectoria del haz. Cuando pasa de mayor a menor se aleja de la vertical y de menor a mayor se acerca.
A mayor densidad la luz disminuye de velocidad y se desfasa de onda. La lente es un disco de vidrio con una o ambas superficies curvadas. Todos los rayos convergen en un punto que es el foco. La distancia focal es aquella distancia que existe entre lente y foco, y depende de la curvatura de la lente. En el foco se forma la imagen. Si el objeto lo ponemos en el foco la imagen se forma en el infinito. Al poner un objeto a una distancia del foco, la imagen se forma en el foco conjugado (a la distancia adecuada del foco conjugado). Por cada punto del objeto p se forma puntos en p´ que dan la imagen invertida y su tamaño depende de la distancia del objeto a la lente. Si la imagen se forma a la misma distancia de la lente son iguales. Si el objeto se coloca lejos de la lente la imagen es más pequeña y si la ponemos más cerca de la lente la imagen es mayor, más grande. Cuando el objeto se coloca dentro de la distancia focal, los rayos divergen, se forma una imagen virtual no invertida, sólo se observa si recogemos los rayos y enfocamos en otro punto.

OJO HUMANO. El ojo humano es una lente, tiene córnea, iris, cristalino (que es la lente) y la retina.
La imagen que se forma en la retina es invertida. Como sólo hay un punto donde se forma la imagen hay que enfocar en el mismo punto para ello está el cristalino que acomoda la curvatura. Pero hay un límite: a menos de 25 cm ya no se puede enfocar. El tamaño depende de lo cerca que esté el ojo. Cuanto más lejos esté el objeto más pequeño se ve. A 25 cm podemos distinguir objetos de 0.1-0.2mm, (límite de resolución), personas que ven muy bien, ya que se obtiene un ángulo de 0.02º que llega sólo a una célula.

MICROSCOPÍA ÓPTICA. Tenemos microscopía simple o compuesta: la simple consiste en una lente con resolución entre 50-300 aumentos y la compuesta son dos lentes y con resolución de varios miles de aumentos. Puede ser: .- M. de fondo o campo claro. .- M. de fondo oscuro. .- M. de contraste de fases.
1.- Microscopio simple. Amplifica el ángulo de 0.02º como si se pudiese acercar más de 25cm y enfocarlo.
Ej. A 2.5 cm de distancia quedaría amplificado 10 veces. Se usa una lente para que el objeto quede dentro de la distancia focal. El microscopio simple es una lupa. Da unos 300 aumentos. El truco es colocar la imagen dentro de la distancia focal, el cristalino las recoge y ya no son divergentes, sino convergentes y se recoge en la retina. El poder de amplificación de la lente es 250mm/distancia focal, las mejores distancias focales son de 0.8mm. 300x es la mayor amplificación posible del microscopio simple o lupa. Este es el microscopio de Leeuwenhoek.

TIPOS DE MICROSCOPIA. La microscopía óptica se realiza a una longitud de onda de 400-700nm (luz visible). .- MICROSCOPÍA DE CAMPO CLARO: Su poder de resolución aumenta con el aceite de inmersión, se usan para ver bacterias. Contraste: Absorbe parte de la luz y por otra parte lo difracta. En las muestras biológicas absorben en el ultravioleta, sólo algunas estructuras pigmentadas absorben en el visible. Para ver el contraste se acude a la tinción..- MICROSCOPÍA DE CAMPO OSCURO: Tiene condensadores especiales, efecto Tyndall (dispersión de la luz). La luz pasa por la periferia del objetivo excepto los rayos difractados por la materia viva al desviarse de su camino normal, se ve todo negro excepto las manchas blancas de la sustancia..- MICROSCOPÍA DE CONTRASTE DE FASES: La luz es una radiación electromagnética que se transmite en forma de ondas. Están en fase dos rayos cuando las ondas se superponen a lo largo del tiempo. La velocidad de la luz en un objeto es inversa al índice de refracción del objeto. Hay un desfase de rayos, y este microscopio hace perceptible esto, resalta unos objetos respecto a otros dependiendo del desfase. Da una imagen oscura en un fondo brillante. Desfase: Cuando el haz incide en la muestra, dependiendo del índice de refracción, se produce una modificación de la velocidad de los haces luminosos que inciden. El hecho de que se modifique la velocidad hace que los haces estén en diferente fase. Estos microscopios aumentan aún más las diferencias de fase aumentando el contraste. Podemos ver material vivo y darle contraste. Al fenómeno por el que se modifican las fases se le llama Interferencia. Tiene dos elementos con los que conseguir la interferencia: .- Un disco que modifica los rayos que inciden. Está con el condensador. .- una placa de base entre ocular y objetivo.
* Microscopio de NOMANSKY.- Se llama microscopio de contraste de interferencia diferencial. Tiene dos prismas paralelos que da una imagen tridimensional al superar las dos imágenes diferentes. Aumenta el contraste por el fenómeno de interferencia..- MICROSCOPÍA ULTRAVIOLETA. Con una longitud de onda de unos200-300 nm, se disminuye por tanto el diámetro del objeto más pequeño. No atraviesa el vidrio por lo que se usan lentes de cuarzo. Este tipo de microscopía se ha ido transformando en una de fluorescencia, dónde las sustancias emiten luz y por ello son perceptibles.

FINALIDAD DE LA MICROSCOPÍA..-Microscopía de campo claro: Muestras teñidas. .-Microscopía de contraste de fase: Células vivas, células no tratadas, microorganismos móviles, división, etc. .-Microscopía de Nomansky: imágenes tridimensionales, se ven órganos internos. .-Microscopía de campo oscuro: Apéndices, prolongaciones superficiales exteriores, se ven objetos más pequeños.

MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA. Es una modificación del ultravioleta. Se basa en la propiedad de los cuerpos fluorescentes para absorber la luz ultravioleta y emitir en forma de luz visible (fluorescencia).
Sólo el condensador tiene que ser de cuarzo. No necesita cámara fotográfica. Las muestras aparecen fluorescentes sobre fondo negro. Existen en la naturaleza compuestos fluorescentes, aunque en otros casos se añade a la muestra un colorante fluorescente llamado fluorocromo. Aplicación.- Inmunofluorescencia. Usa anticuerpos fluorescentes contra una proteína para determinar la situación o localización de dicha proteína.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA EL MICROSCOPIO ÓPTICO. .- En fresco: Para ver el organismo vivo.
- Suspensión celular en medio acuosos. Se cubre con el cubreobjetos para que el plano de la muestra sea muy fino. .- Tinción: Pasos básicos: 1.- Extensión de la muestra en el portaobjetos formando un frotis.
2.- Se fija el frotis por calor o por agentes químicos. Se evita la deformación de las células con el colorante. 3.- Aplicación del colorante. Suele ser un compuesto orgánico con un cromóforo que da el color. Dependiendo de la carga del cromóforo el colorante será: Azul de metileno - Básico (+) Cristal violeta Para ácidos nucleicos y polisacáridos. Safranina Eosina - Ácidos (-) Se fijan a algunas proteínas. Rojo congo- Neutros: Se mezcla ácido más básico. Cosinato de azul de metileno. En algunos casos es necesario añadir un mordiente que se fija a las estructuras celulares y favorece la unión del colorante.

TIPOS DE TINCIÓN.1.- Simple: Aumenta el contraste de la muestra para ver agrupaciones celulares o la morfología externa. Pasos: a.- Extensión. b.- Fijación. c.- Colorante. d.- Lavado y secado. 2.- Negativa: Se tiñe el medio, el colorante no penetra porque tiene carga negativa. Las células no están coloreadas. La imagen es similar a las del campo oscuro, se usa para ver la morfología externa, apéndices, etc. Pasos: Se usa un colorante sin afinidad a las células, es nigrosina o tinta china, forma una estructura coloidal con el medio y no se pegan a las células. Las células no se tienen por qué fijar y así no hay distorsión en ellas. Se mezcla el colorante con la suspensión celular, se extiende y se deja secar. La imagen que da es similar a la del microscopio de campo oscuro.

3.- Tinción diferencial: Se usan para distinguir diferentes grupos bacterianos. Hay diferentes tipos:

• Tinción de GRAM (Gram 1884).- Clasifica las bacterias en Gram+ y Gram-
- Tinción 1ª: Se usa cristal violeta (Básica, +). Con este colorante se tiñen todas las células.
- Mordiente: Lugol (I2-IK). Forma un complejo con el cristal violeta dentro de la célula.
- Lavado: con etanol que es un agente decolorante. Las células GRAM+ no pierden coloración. Las GRAM- quedan incoloras.
- Tinción 2ª: Con colorante de contraste que es la safranina que tiñe las células incoloras.

GRAM+ : Violetas. Pared gruesa que se deshidrata con etanol y no sale el complejo lugol-colorante. Son Bacilos, Cocos, etc.
GRAM- : Rojas. Pared más laxa, con mayor nº de lípidos, el tratamiento con alcohol desorganiza la pared y pierden el colorante. Más porosidad. Son Bacilos no esporulados.
Si a las GRAM+ se las trata con lisoenzima pierden la capa del polisacárido y se convierten en GRAM-.

Tinción ácido alcohol resistencia (Ziehl-Noelsen).- Se usa para determinar la presencia de bacterias de los géneros Mycobacterium y Nocardia. Se basa en la resistencia de estas bacterias a ser decoloradas con una mezcla ácido-alcohol, se debe a la alta concentración de lípidos de su pared, ácidos micólicos. Pasos:
.- Tinción 1ª: con fucxina (básica) en presencia de calor porque no tomarían el colorante. .- Lavado con agente decolorante: ácido alcohol. Si la prueba es positiva da color en caso contrario sale sin color.
.- Tinción 2ª: con colorante de contraste como el azul de metileno.
Prueba positiva: Fucsia
Prueba negativa: Azul.
Se piensa que los ácidos micólicos forman una barrera lipídica que no deja salir el colorante.

3.- Tinciones especiales: Para ver estructuras específicas:

Tinción de cápsulas.- Indicador de probable patogeneidad. La cápsula es una cubierta altamente hidratada, fija mas los colorantes. Se hace por los pasos siguientes: 1.- Tinción negativa seguido de tinción simple, fondo oscuro y célula con halo. 2.- Tinción simple con cristal violeta, se lava con sulfato cúprico, así se consigue que la célula aparezca teñida y alrededor de ella se ve un halo azul brillante debido al sulfato.
Tinción de endosporas.- Formas de resistencia, con pared muy gruesa (de tinción difícil). Se tiñen por una tinción diferencial llamada tinción de SHAFFER-FULTON: 1.- Tinción 1ª: con verde malaquita y calor.
2.- Agua como agente decolorante, una vez que la endospora coge el colorante ya no lo suelta. Sólo queda teñida la endospora y la célula vegetativa está incolora. 3.- Se usa safranina para teñir la célula, se ve la célula roja con la endospora verde dentro. • Tinción de flagelos.- El diámetro de los flagelos es muy pequeño, < de 20 micras. Se añade un mordiente que se fija al flagelo y lo engrosa artificialmente. Posteriormente se hace una tinción simple con fucxina.


MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN. Posee una haz de electrones proyectado desde un cañón electrónico que incide sobre unas lentes electromagnéticas (electroimanes) que dirigen el haz de electrones a la muestra y es recogido en una pantalla fluorescente. Se ve esa imagen por un visor.
Tiene un elevado poder de resolución, de 1-0.5 nm. La longitud de onda de los electrones es de 0.04 nm (10000 veces inferior a la de la luz visible). Se pueden obtener límites de resolución inferiores a 1nm con aumentos de hasta 200000 veces.

CARACTERÍSTICAS:
.- Los electrones transmiten mal en el aire por eso debe ser una columna en vacío. La muestra debe estar deshidratada, en algunos casos se da alteración de las estructuras internas.
.- Los electrones penetran débilmente por lo que no se puede ver una célula entera, sólo vemos secciones de célula.
.- El contraste depende de la masa atómica del material a observar, dependiendo de ésta se da un grado diferente de dispersión de los electrones. Los elementos vivos tienen una masa menor, se tiñen con sales metales pesadas, Au, Pt, W, Pb, U, aumentando el contraste. Esta tinción puede ser positiva, se fija el metal a al célula, o negativa, se tiñe el medio. La tinción negativa permite ver partículas más pequeñas y se usa en el estudio de virus o proteínas, ácidos nucleicos, macromoléculas.


Preparación de la muestra: .- Deshidratación de las muestras.- Se embeben en un material plástico que desplaza el agua (bloque sólido), resina. .- Seccionado de las muestras con el ultramicrotomo, lo ideal es obtener secciones de menos de 10 nm. .- Tinción: Sombreado metálico (con oro o platino) lluvia oblicua de material pesado, al observarse da una idea tridimensional; Réplica para estudio de superficies opacas a los electrones, volátiles al vacío o inestables al bombardeo de los electrones, se recubre la muestra con un material transparente luego se disuelve la materia y obtenemos una réplica; criofractura y criograbado (con carbono) se congela la muestra, el material se corta por fractura siguiendo la línea de la materia.

 

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