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Fraccionamiento celular y centriugacion

 

Se usa en el caso de querer romper las células pero los orgánulos queremos obtenerlos intactos y por separado.  Por ejemplo la extracción de enzimas mitocondriales, ADN del núcleo...

Con este fundamento se obtienen 5 fracciones fundamentalmente.
Ejemplo: tenemos un hígado de ratón y queremos romper los hepatocitos pero no los orgánulos.

1º Homogenización del tejido.

Para ello por ejemplo usamos un potter.
Obtenemos una mezcla roja en un tampón poco drástico.
El tampón lleva:

Sales adecuadas para no romper los orgánulos como puede ser el TRIS clorhídrico a pH 7.

Sacarosa 0,5 M que rompe la membrana plasmática pero no los orgánulos.

Sales de cloruro de magnesio por que las mitocondrias necesitan del ión Cl- para mantener la integridad.

Con la homogenización obtenemos una mezcla viscosa, en estado de semigel.

2º centrifugación a 2500 rpm durante 10 min.

1º precipitado que tiene partículas de mayor peso y volumen como son los núcleos.

2º sobrenadante con el resto de orgánulos.

3º sobrenadante se centrifuga a 9300 rpm durante 10 min:

1º precipitado con mitocondrias (2º orgánulo de mayor volumen de la célula).

2º sobrenadante con el resto de componentes celulares.

4º centrifugación a mayor velocidad, 13000 rpm durante 15 min.

1º precipitado que contiene a los lisosomas.

2º sobrenadante que contiene todos los componentes no separados anteriormente.

5º ultracentrifugación: 33000 rpm durante 60 min.

1º precipitado compuesto por microsomas que son las fracciones de RE, Golgi ...

2º sobrenadante: es la fracción soluble del citoplasma que no esté dentro de los orgánulos.

ENZIMAS MARCADORAS.

Comprobación de resultados. Recurrimos al microscopio electrónico para saber si la fracciones son realmente puras, aunque esta técnica es cara y podemos recurrir a otras técnicas como por ejemplo el uso enzimas marcadoras de orgánulos.

Uso enzimas marcadoras de orgánulos: Consiste en que cogemos una fracción de cada precipitado y medimos la actividad característica de un orgánulo.

Fracción nuclear:  medimos la concentración de ADN de las distintas fracciones. La mayor concentración de ADN debe estar en la fracción nuclear.

Fracción mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las fracciones, el mayor pico debe salir en la fracción mitocondrial.

Fracción lisosomal: actividad de la fosfatasa ácida o alcalina.

Fracción microsomal: actividad de la glucosa-6 fosfatasa.

Fracción soluble: lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad de actividad de las otras enzimas por que supondría que algunos orgánulos se han roto.

CENTRIFUGACIÓN.

TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN.

Analítica: que sirve para determinar propiedades de unos componentes determinados.
Tuvo mucho éxito en los años 70-80 pero necesitaba gran cantidad de material y lo que se analiza este tipo de centrifugación se puede hacer por otros métodos más fáciles.

Preparativa: sirve para obtener grandes cantidades de algún compuesto. Es la más usada. Hay de varios tipos.

La centrifugación se usa mucho en los laboratorios por que da mucha información. Podemos saber el peso molecular de sustancias determinadas, la forma general de las moléculas y podemos separar distintos compuestos.
También se denomina sedimentación, por que es el proceso que se consigue con la centrifugación.

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