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Sedimentación de partículas. Centrífugas

 

Los aparatos que se usan se llaman centrífugas y existen de distintos tipos.
Tienen las siguientes propiedades:

Trabajan a velocidad constante.
Trabajan a temperatura constante

Existen de dos tipos de centrífugas que definen los dos tipos de centrifugación que existen:

Analítica:

Es una técnica bastante en desuso puesto que lo que se consigue con ello también se consigue con otros técnicas más económicas y más fáciles.
Sirven para conocer el grado de pureza de las disoluciones y para conocer el peso molecular de las partículas.
También se puede hallar con la centrifugación preparativa, electroforesis o cromatografía.
Consta de una cámara blindada por que las velocidades usadas son muy altas (por eso deben estar blindadas).

Poseen:

Un sitio para el rotor.  Un motor para mover el rotor. Un sistema de refrigeración, puesto que las velocidades a las que se mueve producen un gran calentamiento. Un Sistema detector óptico: tiene una bombilla que  emite un haz de luz que pasa por la cubeta y es recogido por un espejo y un detector. Tiene otro espejo con otro haz de luz que se usa de referencia. En todo momento observamos como la muestra se mueve por la cubeta.
1El rotor visto desde arriba es circular con dos orificios donde se ponen las cubetas.

1Las cubetas son de cuarzo y si hacemos un corte transversal tiene la siguiente forma.

Se hace así para que todas las moléculas tengan la misma posibilidad de moverse. Con diferentes tiempos se puede calcular el coeficientes de sedimentación de la molécula de la cubeta.

Centrífuga formada por:
           
Cámara
            Rotor con motor para poder moverlo.
            Sistema de control de la temperatura.
            Bomba de vacío.

H Existen dos tipos de centrífuga preparativa:

Ultracentrífugas que trabajan a velocidades entre 15000 rpm y 75000 rpm, deben estar blindadas y con sistemas de vacío.

Preparativa propiamente dicha que trabajan con velocidades hasta de 15000 rpm. No es necesaria las cámaras blindadas con sistema de vacío.
H Tipos de rotores:  (Rotor; es donde se mete la muestra.)

Rotores Vasculantes o flotantes: tienen forma de champiñon y lleva colgado el tubo. Cuando está parado el rotor, el tubo está en una posición vertical y cuando está en movimiento, el tubo está en una posición horizontal.
1 

Se usan para dos tipos de centrifugaciones:

Centrifugaciones zonales.
Centrifugaciones isopícnicas o de equilibrio.

4 Rotores de ángulo fijo: el rotor mantiene un ángulo fijo.
1 

Se usan para Centrifugación diferencial o Centrifugación de frente de sedimentación. Se usa para purificación de material biológico como proteínas. Ambos son formados por aleación de aluminio o de titanio

CENTRIFUGACIÓN PREPARATIVA.

Centrifugación diferencial o de frente de sedimentación:

Inicialmente los componentes de una mezcla ocupan todo el tubo.

Primera centrifugación: aquellas moléculas de alto peso molecular migran más rápidamente hacia el fondo del tubo y resbalan hacia el fondo por la pared del tubo. Van hacia la pared contraria y resbalan por ella.
1 

Al final tenemos dos fases o fracciones: precipitado y el sobrenadante.
El sobrenadante es prácticamente puro y el precipitado no es puro por que las moléculas pequeñas del fondo del tubo pueden ser arrastradas hacia el fondo y quedar atrapadas por las más grandes.

Segunda centrifugación: la impureza del precipitado se soluciona cogiendo el precipitado, redisolviéndolo y haciendo otra centrifugación, lo que enriquece el precipitado en moléculas de alto peso molecular.

D Centrifugación zonal.

La centrifugación zonal separa a las moléculas según su densidad y su peso molecular.
Usa el rotor vasculante.
La muestra se deposita al principio del tubo en la zona de arriba. Encima del líquido de centrifugación
La separación de las moléculas se consigue por que el líquido del tubo es más denso que el líquido donde se aplica la muestra.
Se suele usar una disolución que contiene sacarosa para separar las muestras. La sacarosa  aumenta la densidad del medio de centrifugación.
La muestra está disuelta en una disolución acuosa.
Al final nos sale:
Una franja con moléculas de bajo peso molecular.  Una franja con moléculas de peso molecular intermedio.
Una franja de moléculas de alto peso molecular

Es dependiente del tiempo por que aunque podemos cambiar la densidad del medio puede que no consigamos tener una densidad igual a la de las moléculas que queremos separar y si aumentamos el tiempo de centrifugación pueden caer todas las moléculas en la misma zona.

También se pueden usar como medio de centrifugación, gradientes de sacarosa que pueden ser discontínuos o contínuos:

Gradientes discontinuos:

1º Ponemos una primera disolución al 20% de sacarosa.
2º disolución de sacarosa al 15% (arriba de la de 20%).
3º disolución de sacarosa al 10% (arriba de la de 15%).
4º disolución de sacarosa al 5% (arriba de la de 10%).

Esto genera un gradiente de densidad discontínuo.
Gradientes continuos:

Por ejemplo para hacer un gradiente que vaya desde 5% hasta 25%.
Es fácil de hacer por que se usan formadores de gradientes que apelan al principio de los vasos comunicantes.  

Al principio entra disolución de 25% conforme se abre la llave , va bajando la concentración.
El aumento de la densidad de medio por el tubo representa también un aumento de viscosidad del medio.
Aumento de la concentración de sacarosa, aumenta la densidad y la viscosidad.

[sacarosa]%       densidad (g/cm³)          Viscosidad(unidades relativas).
    
      10                                 1,04                                                 1,33
      20                                 1,08                                                 1,94
      30                                 1,13                                                 3,18

Ley de Stokes: la velocidad está en función de la viscosidad del medio.
La velocidad de una partícula en una disolución sometida a un campo centrifugo G es:

V= d² (ρp - ρ) ·G
            18 h

d= diámetro. ρ p= densidad de la partícula. ρ  = densidad del medio, h = viscosidad,

La viscosidad baja la velocidad de la partícula en el medio
Los avances en esta técnica ha hecho que se puede usar con fines analíticos, así podemos determinar el peso molecular de un componente o determinar su grado de pureza.

Lo que hay que hacer es poner junto con la disolución de una proteína desconocida, una mezcla de marcadores de peso molecular conocido de manera que  podemos determinar su absorbancia (coloración) o la actividad de la proteína (actividad enzimática).
En la centrifugación cada marcador se distribuye a lo largo del tubo y se separan según la ley de Stokes.
Pinchamos en el fondo del tubo y lo conectamos a un colector de fracciones.
El marcados lo identificamos midiendo su actividad enzimática o por absorbancia.
Representamos el peso molecular frente a la absorbancia de los marcadores de peso molecular conocido y podemos extrapolar la absorbancia de la molécula desconocida a la gráfica y conocer su peso molecular.
 

Centrifugación de equilibrio, de sedimentación en gradiente de densidad o isopícnica.

Isopícnica: procede del griego ISO (igual) y PICNOS (densidad).
Hasta ahora hemos considerado que las macromoléculas tienen una densidad mayor que el disolvente. ¿qué ocurre si las macromoléculas tienen igual densidad que el disolvente?.

Ley de Stokes: define la velocidad de sedimentación de una partícula.

Si en algún momento la densidad de la partícula es igual a la del disolvente la velocidad de sedimentación se 0 y no sigue emigrando.

Se usa un disolvente que contiene una disolución de cloruro de cesio que es un compuesto de bajo peso molecular pero de alta densidad.

Los gradientes de cloruro de cesio tienen una propiedad:

Cuando echamos cloruro de cesio y lo centrifugamos, la densidad se distribuye formando un gradiente, siendo mayor la densidad en el fondo del tubo y menor en el menisco.

Cuando colocamos una molécula de densidad intermedia en el menisco y se centrifuga, llega un momento en que la partícula se sitúa en una zona donde la densidad de la molécula es igual a la densidad del cloruro de cesio y no sigue bajando en el gradiente, no sigue emigrando.

Para hacer esta técnica se usa una concentración de cloruro de cesio de 5-7 M.

Se diferencia de la centrifugación zonal (dependiente del tiempo) en que la centrifugación isopícnica es independiente del tiempo, por mucho que aumentemos el tiempo de centrifugación la molécula no se mueve.

No es muy útil para separar proteínas por que entre ellas la densidad es muy parecida y tendríamos a todas las proteínas en la misma banda del gradiente de cloruro de cesio.

Se usa mucho para separar ácidos nucleicos, virus, orgánulos subcelulares y ribosomas.

Usando esta técnica en 1958 Meldenson y Stall demostraron que la duplicidad del ADN es semiconservativa, lo que hicieron fue:

Crecieron bacterias en medio rico en nitrógeno radiactivo (N15, más denso).

Trasladaron las bacterias con ADN marcado con el N15 a un medio con N14 durante dos generaciones.

 Sometieron a las bacterias a una 1ª centrifugación isopícnica a generación 0: observaron que todo el ADN correspondía a una sola banda, debido al N15.
2º centrifugación isopícnica de la 2º generación: observamos un pico de menor densidad que corresponde a ADN con una hebra pesada (N15) y una hebra ligera (N14).
3º centrifugación de la 3º generación: observamos dos picos una con densidad igual a la obtenida en la 2º centrifugación ( ADN con una hebra N14 y otra N15) y otro pico de menor densidad  que corresponde a ADN con dos hebras de N14.

Por tanto sólo se conserva una hebra de ADN la otra es replicada.

 

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