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La Técnica Histológica abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopía óptica o electrónica. Para la obtención de cortes para observar a microscopio, hay que seguir un protocolo en el que se incluye la obtención de la muestra, su corte y montaje.

1. Para empezar con la técnica histológica se debe obtener una muestra del tejido.

2. Fijación: Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas, de manera que mantenemos las células con las propiedades intactas lo mejor posible. Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la autolisis y llevarían a la DEGENERACIÓN POST MORTEM. La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas.

3. Lavado: Se hace para eliminar el exceso de fijador, de manera que podamos luego hacer la inclusión sin interferencia por parte del fijador. Existen medios de inclusión que son hidrófobos y precisan de la eliminación de agua en la muestra. Tenemos pues que hacer una deshidratación. Debido a que una gran parte del tejido está constituido por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor grado de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 0,5%, luego con una solución de 10%, 20%... 80%, 90%, 95% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua. Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápida del tejido y se deformaría.

4. Aclaramiento o diafanización: Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, que solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.

5. Inclusión: Por lo general, los tejidos son estructuras blandas y frágiles, incluso después de la fijación. De tal forma que previo a la obtención de los cortes, es necesario incluirlos en un medio de soporte. Los medios más utilizados son las ceras o resinas. En estado líquido, estos medios tienen la capacidad de penetrar y rodear el tejido, de esta forma se puede producir el endurecimiento (por enfriamiento o por polimerización), para formar un bloque sólido que pueda ser cortado fácilmente en el microtomo. Existe otro método alternativo, que es la congelación rápida del tejido en un medio gelatinoso, que permite el corte tisular directo del fragmento congelado, que puede ser cortado en forma inmediata en un microtomo especial denominado criostato. El objetivo de la inclusión es hacer facilitar la sección del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz y ser examinados mediante el microscopio.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C. Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco. Los medios de inclusión para Microscopía Electrónica comúnmente utilizados son resinas polimerizadas, son parecidas al metacrilato.
6. Corte: El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopía óptica tienen un grosor entre 5 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO, con cuchillas de acero.
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de Congelación de Tejidos. Un tejido congelado, es los suficientemente duro para ser cortado. Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquido para tener una congelación rápida. Luego se corta con un aparato especial denominado MICROTOMO DE CONGELACIÓN, existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de congelación llamado CRIOSTATO. La ventaja de esta técnica es que los cortes que se obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnostico de material patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación. Para Microscopía Electrónica se requieren cortes más delgados (denominados ultra finos) de aproximadamente 600-800 A de espesor y de 0.5 mm. de lado medio. Para esto se utiliza un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O DIAMANTE, que llevan incluidos un pocillo hecho con cinta de plata o aluminio. Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm y que pueden ser de diferentes formas y material.
7. Montaje: Si queremos fijar las muestras una vez cortadas a un portaobjetos para observar a microscopio óptico, utilizamos 2 métodos de montaje:
Baño termostatizado: Consiste en una cubeta dentro de la cual nos encontramos con la solución de montaje, que en nuestro caso está formada por gelatina 1% a 38ºC que hace la función de adhesivo de la muestra en el portaobjeto.Cuando cortamos al microtomo, obtenemos una tirita con los cortes, pegados por los extremos. Esta tirita se pone flotando sobre la solución de montaje. El corte se irá extendiendo ligeramente, eliminándose las arrugas y pliegues debidos al corte, pero no se llegará a derretir, porque la temperatura de la gelatina no alcanza el punto de fusión de la parafina. Luego, con un portaobjetos “pescamos” las muestras. De esta manera obtenemos en un mismo porta varios cortes del mismo bloque o taco de inclusión. Los portaobjetos llevan un tratamiento de limpieza antes de utilizar para permitir mejor la adherencia de los cortes. Por tanto, se lavan antes con agua y jabón y finalmente con agua destilada. Y se guardan con éter y alcohol al 50% en un frasco.
Plancha caliente: Primero hay que preparar una solución de montaje (albúmina, glicerina.) que funcionan como adhesivos. Esta solución la prepararemos a partir de una solución madre que hay que diluir. El portaobjetos lo ponemos sobre la plancha y añadimos la solución de montaje, unas gotas. Sobre la solución de montaje ponemos las muestras a estudiar. Escurrimos el exceso y dejamos secar sobre la plancha. En cualquiera de los dos métodos de montaje, los cortes se guardan al final en una estufa a 38ºC para dejar evaporar la solución de montaje y terminar de adherir, como mínimo 48 horas. Lo podemos dejar cuanto tiempo queramos antes de teñir.
8. Coloración: Indispensable que las muestras sean transparentes o muy claras, y como utilizaremos microscopio compuesto, tenemos que colorear o contrastar. Para teñir un corte de parafina, previamente eliminamos la parafina porque es insoluble en agua, y lo hacemos con un solvente orgánico como tolueno, xilol… En nuestro caso desparafinamos con xilol 3 veces 5 minutos cada vez. Luego tenemos que proceder a la hidratación que se hace con una serie decreciente de alcohol. Utilizamos primero etanol absoluto, luego etanol al 90%, etanol 70% y agua destilada, 5 minutos cada vez. Y ya podemos aplicar la solución acuosa coloreada que sí podrá teñir nuestra muestra. Los cortes ya hidratados se ponen en unos frascos llamados copleen, y no hay que dejar nunca que se sequen las muestras. Después de cada coloración hay que hacer un baño con agua. En el caso de la hematoxilina de Harris (color púrpura) lo dejamos 2 minutos. El lavado se hace con agua corriente, ya que se produce viraje al azul debido a las sales que contiene el agua del grifo, también durante 2 minutos. Y luego lavamos con agua destilada durante 2 minutos. Luego teñimos con eritrosina acuosa 1% 2 minutos; lavamos con agua destilada 2 minutos. Finalmente, para poner el cubre, previamente deshidratamos con etanol 96% 2 minutos y luego etanol absoluto 2 veces 5 minutos cada vez. Aclaramos con xilol 2 veces 5 minutos cada vez. Pegamos el cubre con una sustancia adhesiva llamada eukitt. Y ya lo tenemos preparado para observar.

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