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Transcripcion genetica

 

La transcripción consiste en la copia de 1 cadena de DNA para dar una cadena de RNA, gracias a la complementariedad de bases. La cadena que se copia se conoce como cadena molde o cadena transcrita. Esta cadena será obviamente complementaria al RNA.
Se conoce como unidad de transcripción a aquel DNA que da lugar mediante el proceso de transcripción a una molécula de RNA. No siempre se corresponderá una unidad de transcripción con un gen, ya que en los organismos procariotas podrán existir operones, con lo que se coordinarán varios genes, que se transcribirán de manera simultánea.
Para la transcripción resulta básica la presencia de la RNA polimerasa, ya que este enzima es el encargado de sintetizar el RNA, gracias a la complementariedad con la cadena molde. La RNA polimerasa da inicio a la transcripción cuando se une al promotor. Se conoce como punto +1 al punto donde se inicia la transcripción. El enzima se deslizará por el molde hasta alcanzar la secuencia acabadora, situada en la parte final de la unidad de transcripción. Todos los nucleótidos situados antes de +1 son los situados upstream o hacia 5’. Estos nucleótidos reciben numeración negativa. Los situados después de +1 están situados downstream o hacia 3’.
A lo largo del DNA, las unidades de transcripción pueden situarse en cualquiera de las dos cadenas, lo que implicaría dificultades para ilustrar este proceso. Se ha determinado arbitrariamente, que la transcripción se inicie siempre de izquierda a derecha, desde 3’ a 5’. En paralelo a la cadena de RNA se pone una sola cadena de DNA, pero no la complementaria, sino la que es idéntica al RNA, con las diferencias típicas entre DNA y RNA, como la sustitución de T por U.
El RNA que se forma como resultado de la transcripción, podrá ser el tránscrito primario. Se ha de tener en cuenta que existe tres tipos de RNA, dos de los cuales son productos finales, como el rRNA y el tRNA, mientras que el mRNA deberá llegar a los ribosomas, donde podrá dar lugar a las proteínas.
Dentro del proceso de la transcripción puede haber otras proteínas implicadas, que serán las proteínas reguladoras. Se ha de tener en cuenta que la mayoría de los genes está sometidos a regulación, de manera que existirán diferentes ritmos de síntesis de RNA, con más o menos frecuencia. Esta regulación afecta a la expresión del gen, actuando a nivel de la transcripción normalmente.
Muchas de las cosas anteriormente mencionadas se pueden aplicar tanto a procariotas como a eucariotas, por lo que nos centraremos a partir de este punto en la transcripción en procariotas.
El caso que estudiaremos más el de la bacteria E.coli, que posee unos 5000 genes. Al tratarse de una bacteria, posee un único cromosoma, circular. La regulación se da principalmente a nivel de la transcripción. Siendo una bacteria, posee un sistema de rgulación típico en las bacterias, que es la coordinación de diferentes genes mediante una estructura característica de las bacterias, que se conoce como operones. Los operones permiten la coordinación de diferentes genes bajo un mismo promotor, dando como resultado un único RNA. La inmensa mayoría de los organismos procariotas carece de intrones repartidos a lo largo de su genoma.
La RNA polimerasa es el único enzima de síntesis de RNA, capaz de sintetizar los 3 tipos diferentes de RNA. Existirán 2 tipos de promotores, los fuertes, con un alto índice de transcripción, y los débiles, con una transcripción más reducida. Estos promotores dependen de su afinidad por la RNA polimerasa.

Se trata de una secuencia, cuya única función es la de ser reconocida por proteínas. Nunca se transcribe o traduce. Al realizar el estudio, se buscaba una secuencia conservada en los distintos promotores. Esta secuencia no tenía que estar conservada al 100%, sino que se ha de tratar de una secuencia consenso, para lo cual en cada posición de la secuencia ha de haber una base más frecuente que las demás. Se trata de una secuencia ideal, ya que en realidad es poco probable que se encuentre, ya que la mayoría de las secuencias reales tendrán diferencias con esa secuencia. Cuando se analizó la secuencia consenso se descubrió que:
En el punto de inicio, en +1, se suele encontrar una pruina, en el 90% de los casos. Esta purina suele ser mayoritariamente A.
En la posición –10 encontramos la Pribnow Box.
En la posición –35 se halla otra secuencia consenso.
La distancia entre ambas secuencias suele ser entre 16 y 19 pares de bases, y la distancia óptima es de 17pb.
Las mutaciones en los promotores pueden ser muy importantes, ya que no afectan al producto en sí, sino que afectan a la cantidad de producto que se producirá en la célula. Encontraremos dos tipos de mutaciones en los promotores, que pueden ser o bien “down”, con lo que la producción disminuirá, o bien mutaciones “up”, en las que la producción aumentará. Las mutaciones “down” se producirán debido a que las mutaciones provocarán más cambios en el promotor, respecto a la consenso, o bien provocarán que la distancia entre las dos cajas se diferencia más de la óptima de 17pb. Las mutaciones “up” están producidas por mutaciones que actúen en sentido contrario, con lo que la secuencia del promotor se aproximará más a la consenso o la distancia entre ambas cajas se aproximará a 17pb.
También depende de la similitud con la secuencia consenso la fortaleza de los promotores, de manera que los promotores más fuertes serán aquellos que se parezcan más a la secuencia consenso, mientras que los débiles diferirán más. Si todos los promotores fuesen como la secuencia consenso se perderían opciones de regulación. Existen algunos genes que presentan diferencias con estos promotores, pero se trata sólo de excepciones.
RNA polimerasa (E.coli)
La RNA de E.coli tiene una serie de características que son comunes a las demás polimerasas, pero también tiene características específicas de la RNA polimerasa bacteriana. Algunas características de la RNA polimerasa son:
Está formada por diversas subunidades.
Su función es la de sintetizar RNA a partir de NTP, por lo que necesitarán un DNA molde.
La síntesis de RNA se produce en dirección 3’ – 5’.
No necesita primer.
El enzima entero, el holoenzima, consta de 5 subunidades, distribuidas así: (α2ββ’)σ. Podemos diferenciar dos partes en el enzima, el núcleo o core y la subunidad σ. Si bien el core tiene la capacidad de sintetizar nuevo RNA, sólo el enzima entero sería capaz de realizar correctamente la transcripción, ya que la subunidad σ es básica para el reconocimiento del punto de inicio, ya que sin ella, la transcripción empezaría en cualquier punto.
UnidadGen Peso α RpoA40 KDa β RpoB155 KDa β’ RpoC160 KDa σ rpoD 32 – 90 KDa
El conjunto de toda la RNA polimerasa pesa unos 455 KDa. La función de α es la de mantener unido el enzima y la de permitir la unión de otras proteínas reguladoras. β y β’ forman el centro catalítico, que sintetiza el RNA. Existen antibióticos que pueden actuar a nivel de estas proteínas, como la rifampicina. Estas dos subunidades tienen unidos dos átomos de Zn. σ es la parte que es capaz de reconocer específicamente y de manera estable el promotor. Su función es la de aumentar las probailidades de que
se una donde debe. Una vez se ha iniciado la transcripción, σ se desprende y continúa el core la transcripción. La transcripción consta de 4 partes.
Reconocimiento del promotor
Se cree que la RNA polimerasa está unida al DNA y se va deslizando por encima de él, hasta encontrar un promotor. Se considera probable que el enzima tenga la capacidad de reconocer las estructuras de los puentes de hidrógeno de las cajas de –10 y –35. La RNA polimerasa se coloca principalmente sobre una de las dos cadenas que componen el DNA. El DNA, cuando la RNA polimerasa reconozca al promotor, deberá pasar de un complejo cerrado, con las dos cadenas unidas, a uno abierto, con las cadenas separadas, para poder realizar la transcripción. La región de DNA cuyas dos cadenas se separan va de –9 a +20. Esta es la primera función de la RNA polimerasa, separar las dos cadenas. El enzima completo cubre desde la posición –55 a la +20. Se cree que la secuencia de –35 es la de reconocmiento por el enzima, mientras que la de –10 es la que indica el punto donde se deberían separar las dos cadenas. Se trata de una región rica en T y A, por lo que será más fácil de separar. Además se forma una pequeña curva en el DNA, donde se transcribe, que es básica para el inicio de la transcripción.
Iniciación de la transcricpción
El primer nucleótido puede ser cualquier purina, aunque normalmente se trata de A, en más del 50% de los casos. El inicio de la transcripción es una iniciación abortiva, en la cual la RNA polimerasa sintetiza un oligonucleótido de entre 2 y 9 bases. Después deja ir a este nucleótido e inicia la síntesis de nuevo. Este proceso se repite unas cuantas veces, momento en que se dice que la RNA polimerasa está en forma de iniciación. La subunidad σ sigue unida todavía al RNA en esta fase, hasta que consiga alcanzar la siguiente fase. Es en esta fase cuando la RNA polimerasa puede ser inhibida por la rifampicina.
La fase se conoce como promotor clearance o despeje del promotor. Esta fase implica una limitación de velocidad, el tiempo que tarda en superar esta fase. Los promotores fuertes tardan menos tiempo. Pasado un cierto tiempo, se consigue superar esta fase y se entra en la siguiente fase, mucho más estable.
Fase de elongación
El factor σ se libera y el core del enzima continua la síntesis por su cuenta. Se forma en esta fase loq ue se conoce como burbuja de transcripción, que abarca unos 17 nucleótidos. El Rna permanece unido al Dna unos 12 nucleótidos. Las zonas ricas en A y T se sintetizan de manera más rápida, mientras que las ricas en G y C serán más lentas, siendo conocidas como zonas de pausa. La velocidad de elongación puede ser de entre 30 y 6 nucleótidos por segundo, pero en las zonas de pausa puede llegar a 0,1 nucleótido por segundo. En la etapa de elongación, la RNA polimerasa cubre unos 60 pb. Cuando el RNA tiene unos 15 nucleótidos, el enzima se compacta y pasa a cubrir solo 35 pb. El enzima va avanzando a trompicones, ya que la elongación avanza, pero el frente del enzima no avanza paulatinamente, sino que lo hará de golpe. La elongación implica por lo tanto un proceso de contracción y elongación del enzima.
Terminación de la trancripción
No existe una secuencia consenso a partir de la cual se detenga la transcripción, sino que la terminación de la transcripción se da gracias a secuencias ya transcritas de RNA. Se trata de regiones ricas en G y C, con lo que la polimerasa irá más lenta. Además, en esas regiones, las bases etán colocadas de manera que al irse transcribiendo se de complementariedad en el RNA y se formen bucles o “hairpins”. En E.coli se conocen 2 tipos de terminación de la transcripción.
Intrínsecas o independientes de rho
Este tipo de terminación depende solo de la secuencia. Se trata de regiones ricas en G y C, con simetrías para que se formen los hairpins cerca del final del gen, a unos 20 nucleótidos. Además encontramos una tira de A en la cadena molde, de entre 6 y 8 bases, justo después de la formación de los hairpins.
La presencia de los hairpins provoca una ralentización de la polimerasa, que no será suficiente para terminar la transcripción. La cadena de A provoca que la polimerasa se pueda liberar, ya que es un fragmento muy débil.
Dependientes de rho
Su estructura no está tan bien definida como en el caso anterior. Se cree que existen regiones que permiten la formación de los bucles, pero que en este caso no existe la tira de A al final. Para terminar la transcripción necesita la colaboración de la proteína rho.
Rho es una proteína con función ATPasa. Rho se una al RNA en una relación de 1 a 1. Se cree que rho se va deslizando por la cadena de RNA que está sintetizando la polimerasa, hasta que la alcanza, ya que está frenada en los bucles. La proteína es un hexámero que necesita unos 50 nucleótidos para poderse unir al RNA. Puesto que en bacterias la síntesis de proteínas se da de manera simultánea a la transcripción, la proteína rho no se podrá unir hasta que se haya sobrepasado el codón de terminación, mientras que la transcripción continuará más allá.
En E.coli existe un factor que se puede unir a la polimerasa, siempre y cuando no este σ. Este factor se conoc como NusA podría provocar que la polimerasa se frenase al llegar al bucle del final.
REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN.
Distinguimos entre 2 tipos de genes, por un lado los genes estructurales, cuyos productos son enzimas o proteínas estructurales, y por el otro los genes reguladores, que codifican para proteínas reguladoras que pueden ser activadoras o represoras.
Operones
Se trata de regiones que contienen una serie de genes que codifican para proteínas de una misma vía metabólica, siendo coordinado todo por una misma región reguladora.
Existen operones de control positivo, activadores, y otros de control negativo, represores. Los activadores promueven la transcripción. Sólo se producirá la transcripción si está la proteína reguladora. Los negativo inhiben la transcripción, de manera que sólo se dará la expresión si no está la proteína reguladora.
En procariotas se suele tratar de control negativo, mientras que en eucariotas suele ser de control positivo. También podemos clasificar los operones en función de si son inducibles o reprimibles. En función de esto hablaremos de inductor o coactivador e inhibido o correpresor, respectivamente.
Operón Arabinosa Lo constituyen los genes de los enzimas del metabolismo de la arabinosa.
El gen araC codifica para la proteína reguladora C. C es un activador, solo si está unido a la arabinosa. El operón también es sensible a la glucosa, ya que si la concentración de glucosa es baja, habrá más CAP – cAMP, con lo que se activará la transcripción. Si la concentración de glucosa es alta, pasará lo contrario. El CAP – cAMP es tambien activador. La proteína C es capaz de autorregularse, inhibiendo su propia síntesis. Existen tres lugares de unión de la proteína C, marcados en el esquema superior. AraO1 es donde se une proteína C para autorregularse, ya que impide la transcripción del gen araC. AraI y araO2 actúan de manera conjunta en la regulación del promotor BAD.
En presencia de arabinosa, la proteína C estimulará la síntesis de los productos codificados por los genes BAD. Si no hay proteína C, se estimulará la sítntesis de ésta. Si no hay arabinosa, se formará un bucle que impedirá que haya transcripción de los genes BAD.
En resumen, para que haya transcripción ha de haber arabinosa, proteína C y Cap – cAMP. Si no hay arabinosa, la proteína C se unirá a araI y a araO2, con lo que se formará el bucle represor, por lo que no habrá síntesis. La formación del bucle depende de la presencia de arabinosa.
La proteína C actúa como un homodímero. Cada una de las subunidades tiene un dominio de unión a DNA y otro dominio de polimerización. En el dominio de polimerización encontramos el punto donde se une la arabinosa. Existe un brazo que une los dos dominios, y además un pequeño brazo en el extremo amino terminal. En ausencia de arabinosa, el dímero irá desde araI a araO2, provocando la formación del bucle. Si hay arabinosa, ésta se unirá al dímero, lo que provocará un cambio conformacional que hará que el brazo amino terminal se repliegue y no se una al dominio de unión a DNA. La proteína C se una a araI1 y a araI2. La presencia del bucle represor impide que la RNA polimerasa llegue a cualquiera de los promotores, y además impide la unión del CAP – cAMP.
Respuesta SOS en E.Coli
Se trata de un conjunto de mecanismos que se observan cuando se somete a las células a daños considerables en su DNA, a causa de rayos UV, por ejemplo. Se trata de una capacidad incrementada de reparación del DNA. Los responsables de esta capacidad son los genes SOS, de los que se conocen entre 15 y 20.
Todos estos genes están regulados de manera coordinada por la proteína represora LexA, del gen lexA. Se conce este mecanismo como regulón. Existe un gen, el recA, que codifica para la proteína RacA, que es la inductora de la respuesta del regulón. El gen lexA es capaz de autorregularse, y de regular a recA. La proteína RecA se activa al sufrir daños, provocando la degradación del represor.
En una situación normal,LexA está reprimida, por lo que no habrá transcripción de los genes SOS, y sólo habrá transcripción basal de lexA y de recA. En una situación donde se producen daños, RecA se activará, degradando la proteína LexA, por lo que se iniciará la transcripción de los genes SOS, con lo que también habrá una mayor transcripción de los genes recA y lexA.
La transcripción de los genes SOS estimula los mecanismos de reparación de la célula, como por ejemplo los genes uvrA, uvrB,...
La síntesis de recA inhibe la acción incrementada de recA. Cuando cesa la situación de emergencia, se puede volver a reprimir los genes SOS, debido a la síntesis existente de lexA.
Activación de RecA
No se conoce el mecanismo exacto in vivo, pero se cree que en condiciones in vitro la proteína es capaz de reconocer cadenas de DNA sencillas, de una sola cadena. Esto sólo se ha podido comprobar in vitro. Los promotores de los genes SOS han de tener alguna secuencia conservada, de manera que puedan ser reconocidos por LexA. Se ha comprobado que todos tienen lo que se conoce como la caja SOS. Se trata de una secuencia consenso. La caja SOS consta de 20 nucleótidos, de los cuales 7 son siempre iguales. La posición de la caja SOS va variando. El gen uvrB está regulado sólo en parte por el sistema SOS, ya que tiene 2 promotores y solo un sistema SOS. Parece ser que siempre habrá un mínimo de transcripción de uvrB, por lo que habrá un sistema de reparación rápido.
Esporulación en B.subilis
Puede existir en 2 fases morfológicamente diferenciadas. Puede ser una célula vegetativa normal en un medio rico, o se una célula vegetativa en un medio pobre. En un medio rico, se dividirá por multiplicación, pero en un medio pobre se dará una división asimétrica. El resultado de esta división será de dos células. Una célula dará lugar a la espora, mientras que la otra célula lisará.
Este proceso está regulado transcripcionalmente. El proceso dura unas 8 horas e implica grandes cambios en las características y capacidades de la bacteria. Algunos genes de la etapa vegetativa dejan de expresarse y se expresan otros que antes no se expresaban.
La esporulación va asociada a cambios en la subunidad σ. Dependiendo de la subunidad σ que esté asociada en un momento dado, se reconocerán unos u otros promotores. Normalmente se denominaba a las unidades σ por el peso molecular, pero actualmente se emplean letras. LA σ característica de las bacterias y la mayoritaria es la σ55 o σA. Esta forma se encuentra en un 90% de los casos. El cambio de la subunidad σ provocará que se reconozcan otros promotores. En ambos compartimentos sucede lo mismo, al cambiar la subunidad σ se inicia la transcripción de diferentes genes, entre los que habrá otra unidad σ. Esta unidad σ sustituirá a la que está unida a la polimerasa, iniciando la transcripción de otros genes. Este proceso se irá dando hasta que se forme la espora y la célula madre lise.
Resulta básico para el funcionamiento del proceso el hecho de que E y F han de activarse solo en la parte que les toca, por lo que deberán estar inhibidos allí donde no se les necesita. Actualmente se sabe que:
F puede formar un complejo con SpoIIAB, de manera que si se libera de esa proteína, resultará activado.
SpoIIAB está controlado por SpoIIAA. Si SpoIIAA no está fosforialdo, se puede unir a SpoIIAB, con lo que esta proteína no se podrá unir a σF, que será activa. Si AA está fosforilado, σF será activo.
El encargado de fosforilar SpoIIAB es SpoIIE, sólo en la espora.
El proceso de activación de σE es más complejo, y se da por rotura proteolítica, mediante la proteasa SpoIIGA, que está situada en el tabique de separación de espora y célula. Esta proteína resulta activada por SpoIIR, que se transcribe por acción de la polimerasa unida a σF. El proceso de activación de σK es muy similar al de la σE, pero con IVF y IVB en lugar de GA y R. Este proceso está muy claro en los esquemas.
La activación de SpoOA se da por fosforilación, respondiendo a señales externas, debido a ciertas condiciones ambientales, en un proceso mediado por quinasas. La activación de SpoOA activa la cascada de factores σ que se ha descrito anteriormente. Se ha de tener en cuenta que existe comunicación entre ambos compartimentos de la célula, tanto espora como célula madre.
Existen otros organismos procariotas que pueden tener diferentes unidades σ, como por ejemplo E.coli. El cambio de unidades σ se como respuesta al cambio de determinadas condiciones ambientales, activando así los genes necesarios para responder a esa condición. E.coli tiene como principal σ la 70, pero también podemos encontrar otras como la 32 o la 54. Los genes que las codifican son respectivamente rpoD, rpoH y rpoN.
Se sustituye la 70 por la 32 en condiciones de shock térmico, permitiendo así la transcripción de 17 genes. Uno de los primeros genes en transcribirse, aún por la 70 es el rpoH, que permitirá la posterior transcripción del resto de genes. La unidad 54 se activa cuando en el medio no hay N suficiente, permitiendo así el aprovechamiento de fuentes alternativas de N.
REGULACIÓN DEL CICLO DEL FAGO λ
En los años 50, A. Lwoff, observó que cepas de E.coli sometidas a UV, después de 90’, dejaban de crecer y lisaban, liberando fagos λ. Si estos fagos λ infectaban otras cepas de E.coli, algunas lisaban, mientras que otras seguían creciendo, a no ser que se las sometiese a radiación UV, cuando lisaban y liberaban fagos. Este ciclo debía estar regulado a nivel de transcripción. Fue estudiado por Jacob y Monod, que ganaron el Nobel.
Fago λ
Tiene DNA de cadena doble, lineal, pero tiene extremos cohesivos cos, que al entrar en las células bacterianas se circularizan. El DNA tiene unas 48,5 Kb, aproximadamente unos 40 genes. Muchos de estos genes están organizados en forma de operones, en muchos casos. Diferenciaríamos entre genes tempranos y tardíos. Dentro de los tempranos distinguiríamos entre inmediatos y retardados. Cuando el fago entra en una bacteria, siempre se inicia una la síntesis de los genes tempranos. Si se expresan los genes tardíos, se entrará en fase lítica.
Genes tempranos inmediatos
Gen N: Codifica una proteína, N, que es un factor antiterminador, que provoca la expresión de los genes tempranos retardados.
Gen cro: Impide la síntesis del represor. Acaba la expresión de los genes inmediatos tempranos cuando ya no se necesitan.
Genes tempranos retardados
Genes de recombinación
Genes de replicación
Genes de regulación: cII, cIII y Q
cII y cIII son necesarios para iniciar la transcripción del gen cI
Q codifica la proteína Q, que es un factor antiterminador que permite la transcripción de los genes tardíos
Una vez se ha sintetizado la proteína N, ésta proteína impide que la polimerasa se detenga en el terminador, permitiendo que se transcriban los genes que hay al otro lado. Permiten saltarse los terminadores.
Los genes tardíos se sintetizan a partir de un promotor, el PR’. Es constitutivo, pero tiene un terminador TR’ situado. Si no hay proteína Q, no se podrá superar el terminador. Por lo tanto, es la proteína Q la que permite sintetizar los genes tardíos.
La lísis está ligada a la antiterminación. Se necesita que los genes tempranos inmediatos esten adyacentes a los retardados, solo separados por lo terminadores. Estos procesos de antiterminación se pueden dar en muchos fagos, pero se descubrieron en λ.
Se conocen como genes adyacentes aquellos genes separados únicamente por los terminadores.
El lugar de reconocimiento es diferente del lugar de actuación. Son básicas para este proceso las cajas nut. La proteína N actuará en la caja nut, permitiendo así a las polimerasas sobrepasar los terminadores. Conocemos dos cajas nut, la nutL y la nutR, en función de si permiten sobrepasar el terminador TL o TR1. Estas cajas nut son las que permiten pasar de los genes inmediatos tempranos a los retardados. Cuando la polimerasa pasa por la caja nut, la proteína N se le une, permitiendo así que supere los terminadores. La caja qut desempeña una función idéntica en la antiterminación para pasar a los genes tardíos.
Además de la proteína N harán falta otros factores, que serán los factores Nus, como Nus A, Nus B – S10 o Nus G. Sin estos factores no habrá antiterminación. En principio Nus A sería un factor terminador, pero a partir de N se organiza un complejo proteico necesario para que la polimerasa no se detenga en los terminadores.
Lisogenia
Asociada al gen cI. En el operador es donde actúa la proteína reguladora. Tenemos 2 operadores enabalgados sobre el promotor, que son OL y OR. De manera, que si está unida la proteína reguladora, la polimerasa no podrá acceder a los promotores PL y PR, por lo que acabará el ciclo lítico. CI es el represor que se unirá a los operadores. En OL no permite la transcripción de los genes N y de los siguientes, a partir del promotor PL. Por el OR no se permite la transcripción de cro, a la vez que se estimula la síntesis de cI, de manera que para sintetizar cI necesitaremos cI. Mientras haya cI se sintetizará más cI, lo que explica que la lisogenia sea estable. Lo es hasta que por alguna razón se degrada cI o ésta deja de ser funcional.
Esta misma región es la responsable de la inmunidad que presenta la bacteria frente a otras infecciones, ya que el represor actuará sobre todos los operadores, los del fago original y sobre los de la nueva infección.
Se han aislado diferentes tipos de mutantes:
- cI-: No pueden sintetizar el represor. Siempre entrarán en la vía lítica.
- λ vir: mutación en la región operadora. La proteína CI no podrá unirse, por lo que entrará en la vía lítica.
Si uno de los primeros mutantes infecta un fago lisogénico no habrá lisis, pero si la nueva infección se produce por el segundo mutante se producirá la lisis.
Para iniciar la síntesis de CI hay una vía alternativa. Si se sintetizan CII y CIII, que son proteínas retardadas, que actúan como reguladoras positivas, provocando la síntesis de CI. CII es un activador necesario para la síntesis de CI. Pero CII es muy inestable y fácilmente degradable por los mecanismos de degradación de la bacteria. Actuará CIII para estabilizarla. Por lo tanto, se sintetizará CI a partir de la unión de CII y CIII al promotor de establecimiento, PRE. Este promotor promueve la entrada en la fase de lisogenia. El promotor provocará la transcripción de un mensajero que pasará por cro hasta cI, pero lo que se transcribirá de cro será antisentido, por lo que no dará ninguna proteína, mientras que los de CI si será correcto. Este transcrito antisentido de cro se podrá unir al transcrito sentido de cro, inactivándolo, ya que cro está relacionado con la lísis. La otra mitad del transcrito sintetizará CI, que se unirá a los operadores e iniciará la entrada en lisogenia, que se mantendrá estable gracias a la autorregulación.
Lísis
Cro está asociada a la lisis. Es una proteína represora del represor, de cI. Se trata pues de un antirrepresor. Se une a OR y a OL, igual que CI. Una vez se ha unido a los operadores, impedirá la síntesis de CI. También inhibe la síntesis de los genes tempranos que ya no son necesarios.
Por lo tanto, la lisis o la lisogenia dependerán de la unión de cro o de cI a los operadores OR y OL. Cada una de las regiones operadoras consta de 3 regiones de unión al represor. OR3 está superpuesta a PM, mientras que OR2 está parcialmente superpuesta a PR y OR1 está totalmente superpuesta a PR. Por otro lado, OL1 está superpuesta a PL y OL2 está parcialmente superpuesta a PL.
CI se une preferentemente a 1. La afinidad por 1 es unas 10 veces más alta. Cuando el represor en forma de dímero se une a 1, se unirá otra unidad automáticamente a 2, ya que presenta una elevada cooperatividad. Para que se una a 3 hará falta una elevada cantidad de represor. La polimerasa no podrá transcribir. Se impedirá por lo tanto la transcripción por PR, pero se seguirá pudiendo transcribir por PM. Con una elevada cantidad de represor, se impedirá también esa síntesis.
Proteína CI
Es un dímero con dos dominios N terminales que contactarán con el operador. Los extremos C terminales serán los encargados de formar el dímero. Cada una de las subunidades pesa 27 KDa y tiene unos 236 AA. Cuando se degrada se rompe a nivel del puente conector de los dos dominios, por lo que no podrá actuar como represor.
Si cro está en OR/L 1, se unirá tambien a 2, con lo que podrá haber síntesis desde PR/L. SI hay CI en OR2, entonces habrá transcripción desde PM, pero si se une CI a OR3, entonces ese promotor tampoco podrá ser usado para la síntesis.
Proteína Cro
Pesa 9 KDa y tiene unos 60 AA. Se trata de un dímero, pero con solo un dominio. Tiene más afinidad por el sitio 3, tanto de OR como de OL, unas 10 veces más que por los otros dos sitios. Se une a 1 y 2 sin cooperatividad. Si cro solo está en 3, se podrá transcribir desde los PR y PL, y se impedirá la transcripción desde PM, con lo que se producirá la lisis y se acabará la lisogenia. Si cro está en 1, 2 y 3, enonces no habrá síntesis desde ningún promotor.
Con la radiación ultravioleta, se activarán los genes SOS, debido a la activación de RecA, que inactivará Lex A. Rec A también rompe los conectores de CI, induciendo la lisis. El dominio de unión al DNA en muchas proteínas está formado por hélices α, que en algunos casos pueden ser las que contacten directamente con el DNA. En CI tenemos 5 hélices. La 3 es la encargada de unirse al DNA, mientras que la 2 es la que posiciona la 3 correctamente, y las demás no intervienen. La unión es por puentes de H entre AA y nucleótidos. Se formarán 3 contactos entre la proteína y el DNA: Glu – A; Ser – G y Ala – G. Este es el caso de OR1, donde los dos primeros son más frecuentes. En OR3 solo se establecerán 2 puentes de hidrógeno, debido a una menor afinidad.
La proteína Cro se une al DNA de manera similar. Establece 4 uniones con OR3: Glu – A; Ser – G; Asn –A y Lys – G. Las uniones más frecuentes son también las dos primeras. En OR1 solo podrá establecer 2 puentes de H.
Lisis o lisogenia
A continuación veremos un resumen de la entrada en lisis o lisogenia, en función de los factores que se unan al DNA.
- Cro se une al promotor de CI y ésta no se puede sintetizar: lisis.
- CII y CIII presentes y activos: lisogenia.
- CII y CIII: Si cII no es activa o no está acompañada de CIII, lisis. Si son activos se realizará la síntesis de CI a partir del promotor de establecimiento.
- Si la bacteria vive en un medio rico, la bacteria tendrá proteasas activas y fuertes, con lo que se degradadará CII y se entrará en lisis, lo que beneficiará al virus. Si el medio es pobre, entrará en fase de lisogenia.
- Si la bacteria es mutante en los genes de las proteasas, no inactivarán CII y habrá una alta frecuencia de lisogenia.
Integración del DNA y escisión
Para la integración del DNA, el virus necesitará la proteína Int. Para la escisión harán falta la proteína Int y la Xis. Existen 2 mecanismos de control. Por un lado a nivel de la presencia o no de CII y por otro a nivel de degradación de DNA.
Si hay CII, el virus entrará en lsiogenia, para lo cual deberá haber niveles alto de Int y bajos de Xis. CII se une al DNA a nivel del promotor de Int, activando la transcripción de este gen. El promotor de int está en xis.
Establecimiento de la lisogenia
Necesitará altos índices de Int, cuyo promotor está en xis. CII actuará como activador, pero también puede haber síntesis a partir del promotor PL. Será necesario, no obstante, CII para que se transcriba desde el promotor de int, lo que impedirá la transcripción de xis, con lo que entraremos en lisogenia. Existirá, además, transcripción de xis desde PL, pero los niveles de Int serán más altos que los de Xis, por lo que se realizará la fase lisogénica.
El promotor de Int tiene un terminador que finaliza la síntesis justo después de int, pero en el caso de PL, no se acaba en ese punto, sino que se transcribirá xis, ya que estará presente la proteína N, que se unirá a la polimerasa en la caja nut. Si se comienza a nivel del promotor de Pint, no se pasará por la caja nut y no se sobrepasará el terminador.
Lisis
Si hay mucha Xis y poca Int, se entrará en fase de lisis. Esto podrá estar ocasionado por niveles bajos de CII, con lo que la transcripción desde Pint será baja y la mayor parte de la transcripción se hará a partir del PL. En este caso deberíamos tener igual cantidad de Xis que de Int. Pero después de transcribir int, existe la secuencia sib, que también se transcribe. Esta secuencia formará un bucle que atraerá la RNAasa III, con lo que se degradará. Se degradará también en parte int, pero el daño al RNA no llegará a xis, con lo que se podrá transcribir la proteína Xis. Este tipo de regulación se llama retroregulación. No se trata de regulación a nivel de transcripción, sino que afecta a la estabilidad del transcrito.
Inducción
Para volver al ciclo vírico harán falta Xis e Int. Entre Int y Sib está la zona d erecombinación entre el fago y la bacteria, para la zona attB. Sib quedará por lo tanto al lado contrario de Xis e Int, por lo que el RNA no se degradará como se ha descrito antes.
En el caso de este fago λ, se produce una modificación de la polimerasa por acción de las proteínas antiterminadoras, para poder pasar a transcribir otros genes. En el caso del fago Sp01, de B.subtilis, se produce una modificación de la polimerasa a nivel de la incorporación de una nueva σ, que reconocerá otros genes. Este es el caso también del fago T4. En el caso de los fagos T3 y T7, se produce una nueva RNA polimerasa, producto de los genes tempranos, de manera que se reconocerán los promotores del DNA, de los siguientes bloques de genes.

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